Простые и сложные методы окраски микроорганизмов. Методы окраски микробиологических препаратов. Структура клеточной стенки
Окраска микроорганизмов (крашение микробов) - комплекс методов и приемов для исследования внешнего и внутреннего строения микроорганизмов, метод микробиологической техники, позволяющий различать виды микроорганизмов. Метод широко используют в прикладной бактериологии для определения формы, размеров, строения, локализации, взаимного расположения микробов, структуры их органелл. Без окраски микробы, кроме некоторых грибов, в световой микроскоп практически не видны, вследствие их малой контрастности. После обработки мембраны и/или органеллы микробов приобретают контрастирующую с фоном окраску.
// Общие сведения о методе
Препараты микробов подвергают действию химических реагентов, обычно - красителей, или тетраоксида осмия. В результате физико-химического процесса взаимодействия красителя с химическими соединениями объектов, с целью искусственного придания ему определённой окраски, появляется возможность определить вид микроорганизма, или хотя бы тип его мембраны (см. окраска по Граму).
Способы крашения разделяют на витальный, поствитальный и негативный, последний может быть витальным и поствитальным.
Витальный способ окраски
Для витального (прижизненного) крашения применяют 0,2-0,001 % водные растворы метиленового и толуоидинового синего, нейтральрот и конго красный, которые добавляют в придавленную или висячую капли культуры. Этим способом выявляют спирохеты, простейшие, определяют подвижность бактерий, иммунное набухание капсулы, но использование его требует строгого соблюдения правил, исключающих лабораторное заражение.
Поствитальные способы окраски
Способы крашения фиксированных препаратов (поствитальные) разделяют на простые и сложные. При простых способах красящие растворы фуксина Пфейффера (экспозиция 1-2 мин), щелочного метиленового синего (3-5 мин) наносят на фиксированный препарат, так, чтобы он полностью покрыл мазок, краситель сливают, препарат промывают струйкой воды, встряхивают, высушивают и микроскопируют.
Простые способы позволяют судить о величине, форме, локализации, взаимном расположении отдельных клеток, но с их помощью нельзя установить структуру микробов и часто их дифференцированное отношение к красителям.
Из сложных способов крашения бактерий в основном используют дифференцированный способ Грама, выявление кислотоустойчивости по Цилю - Нельсону, определение волютиновых зёрен по Леффлеру или Нейссеру, дифференцирующий способ Романовского - Гимзы, негативно-позитивный способ определения капсулы по Гинсу - Бурри, выявление спор по Пешкову или Цилю - Нельсону и др.
Для крашения простейших применяют способ Романовского - Гимзы и окраску гематоксилин-эозином.
Грибы исследуют неокрашенными или способами Грама, Циля - Нельсона, Леффлера, Романовского - Гимзы, а также раствором Люголя, лактофуксином и др.
Метод Грама - метод окраски микроорганизмов для исследования, позволяющий дифференцировать бактерии по биохимическим свойствам их клеточной стенки. Предложен в 1884 году датским врачом Г. К. Грамом.
По Граму бактерии окрашивают осно́вными красителями - генциановым или метиловым фиолетовым и др., затем краситель фиксируют раствором йода. При последующем промывании окрашенного препарата спиртом те виды бактерий, которые оказываются прочно окрашенными, называют грамположительными бактериями - в отличие от грамотрицательных (Грам (−)), которые при промывке обесцвечиваются.
// Использование в диагностике
Окраска по Граму имеет большое значение в систематике бактерий, а также для микробиологической диагностики инфекционных заболеваний.
Грамположительны кокковые и спороносные формы бактерий, а также дрожжей, они окрашиваются в иссиня-чёрный (тёмно-синий) цвет.
Грамотрицательны многие неспороносные бактерии, они окрашиваются в красный цвет, ядра клеток приобретают ярко-красный цвет, цитоплазма - розовый или малиновый.
Техника проведения окраски
Окраска по Граму относится к сложному способу окраски, когда на мазок воздействуют двумя красителями, из которых один является основны́м, а другой - дополнительным. Кроме красящих веществ при сложных способах окраски применяют обесцвечивающие вещества: спирт, кислоты и др.
Для окраски по Граму чаще используют красители трифенилметановой группы: генциановый, метиловый фиолетовый или кристаллвиолет. Грамположительные Грам (+) микроорганизмы дают прочное соединение с указанными красителями и йодом. При этом они не обесцвечиваются при воздействии на них спиртом, вследствие чего при дополнительной окраске фуксином Грам (+) микроорганизмы не изменяют первоначально принятый фиолетовый цвет.
Грамотрицательные Грам (−) микроорганизмы образуют с основными красителями и йодом легко разрушающееся под действием спирта соединение. В результате микробы обесцвечиваются, а затем окрашиваются фуксином, приобретая красный цвет.
Подготовка материала для окраски
Исследуемый материал распределяют тонким слоем по поверхности хорошо обезжиренного предметного стекла. Приготовленный мазок высушивают на воздухе и после полного высыхания фиксируют. Гистологические срезы готовят по рутинной методике, фиксируя кусочки тканей в формалине и заливая в парафин.
Фиксация
При фиксировании мазок закрепляется на поверхности предметного стекла, и поэтому при последующей окраске препарата микробные клетки не смываются. Кроме того, убитые микробные клетки окрашиваются лучше, чем живые.
Различают физический способ фиксации, в основу которого положено воздействие высокой температуры на микробную клетку, и химические способы, предусматривающие применение химических средств, вызывающих коагуляцию белков цитоплазмы.
Физический способ фиксации
Предметное стекло с препаратом берут пинцетом или I и II пальцами правой руки за рёбра мазком кверху и плавным движением проводят 2-3 раза над верхней частью пламени горелки. Весь процесс фиксации должен занимать не более 2 с.
Надёжность фиксации проверяют следующим приёмом: свободную от мазка поверхность предметного стекла прикладывают к тыльной поверхности левой кисти. При правильном фиксировании мазка стекло должно быть горячим, но не вызывать ощущения ожога.
Химический способ фиксации
Для фиксации мазков применяют метиловый спирт, ацетон, смесь Никифорова (смесь этилового спирта 96 % и наркозного эфира в соотношении 1:1), жидкость Карнуа (этилового спирта 96 % - 60 %, хлороформа 30 %, ледяной уксусной кислоты 10 %), спирт-формол (40% формалин 5 мл, этиловый спирт 96° - 95 мл). Предметное стекло с высушенным мазком погружают в склянку с фиксирующим веществом на 10-15 минут и затем высушивают на воздухе. Применяется также фиксация в парах 40% формалина в течение нескольких секунд.
Процесс окрашивания мазков
На фиксированный мазок наливают один из осно́вных красителей на 2-3 минуты. Во избежание осадков окрашивают через фильтровальную бумагу.
Сливают краску, аккуратно удаляют фильтровальную бумагу. Мазок заливают раствором Люголя или йодистым раствором по Граму (водный раствор йодида калия и кристаллического йода в соотношении 2:1) на 1-2 минуты до почернения препарата.
Раствор сливают, мазок прополаскивают 96° этиловым спиртом или ацетоном, наливая и сливая его, пока мазок не обесцветится и стекающая жидкость не станет чистой (приблизительно 20-40-60 секунд).
Тщательно промывают стекла в проточной или дистиллированной воде 1-2 мин.
Для выявления грамотрицательной группы бактерий препараты дополнительно окрашивают фуксином или сафранином (2-5 мин).
Промывают в проточной воде и высушивают фильтровальной бумагой.
Техника окраски бактерий в гистологических срезах по Граму-Вейгерту
Депарафинированные срезы доводят до воды.
Окрашивают 20 мин в 1% растворе парарозанилина или основного фуксина в 1 % уксусной кислоте (раствор красителя нагревают до кипения, охлаждают и фильтруют).
Промывают в 3 сменах дистиллированной воды.
Окрашивают 5 мин в 1% кристаллического фиолетового в дистиллированной воде.
Быстро ополаскивают в 1% растворе хлорида натрия.
Обрабатывают 30 с в смеси: 1 часть йода + 2 части йодида калия + 100 частей дистиллированной воды.
Промокают фильтровальной бумагой.
Дифференцируют, нанося на срез смесь равных объемов анилина и ксилола (1 - 2 мл); растворы сливают до тех пор, пока облачка красителя не перестанут отходить от среза.
Проводят через 3 смены ксилола
Заключают в бальзам или любую смолу, растворенную в ксилоле.
Результат: грамположительные бактерии сине-черные, фибрин фиолетовый, ядра красные.
Метод Пешкова применяется для окраски эндоспор бактерий.
Техника окрашивания
Высушенный препарат из культуры грамположительных бактерий фиксируют в жидкости Карнуа в течение 15 минут, затем промывают водой, наливают метиленовый синий по Леффлеру и нагревают до появления паров, кипятят 15-20 минут, после охлаждения препарата промывают и докрашивают 0,5% водным раствором нейтрального красного или фуксина по Пфейферу 30-60 секунд. Высушивают с помощью фильтровальной бумаги и микроскопируют.
Результат окрашивания
В результате зрелые эндоспоры окрашиваются в голубой цвет, молодые - в темно-синий, цитоплазма красная, зерна хроматина окрашиваются в фиолетовый цвет.
Метод окраски по Цилю - Нельсену - метод окраски микроорганизмов для выявления кислотоустойчивых микобактерий (возбудителей туберкулёза, микобактериозов, лепры), актиномицетов и других кислотоустойчивых микроорганизмов. Кислотоустойчивость микроорганизмов обусловлена наличием в их клетках липидов, воска и оксикислот. Такие микроорганизмы плохо окрашиваются разведёнными растворами красителей. Для облегчения проникновения красителя в клетки микроорганизмов нанесённый на препарат феноловый фуксин Циля подогревают над пламенем горелки. Окрашенные микроорганизмы не обесцвечиваются слабыми растворами минеральных кислот и спирта.
Метод назван именами немецких медиков - микробиолога Франца Циля (1857-1926) и патологоанатома Фридриха Нельсена (1854-1898), которые разработали его в 1882-1883 гг.
Этапы окраски
1. Фиксированный мазок покрывают плоской фильтровальной бумагой и наливают на неё феноловый фуксин Циля. Мазок подогревают над пламенем горелки до появления паров, затем отводят для охлаждения и добавляют новую порцию красителя. Подогревание повторяют 2-3 раза. После охлаждения снимают фильтровальную бумагу и промывают препарат водой.
2. Препарат обесцвечивают путем погружения или нанесения на него 5%-го раствора серной кислоты или 3% солянокислого спирта и промывают несколько раз водой.
3. Окрашивают препараты водно-спиртовым раствором метиленового синего 3-5 минут, промывают водой и высушивают.
При окраске по методу Циля - Нельсена кислотоустойчивые бактерии приобретают интенсивно красный цвет, остальная микрофлора окрашивается в светло-синий цвет.
Окраска по Романовскому - Гимзе цитологический метод окраски простейших, бактерий, клеточных структур и тканей различных видов (в том числе крови) при световой микроскопии. Окрашивает ацидофильные образования в различные оттенки красного цвета, базофильные - в цвета от пурпурного до синего.
// Приготовление красителя
Готовый жидкий краситель перед окрашиванием мазков разводят из расчета 1-2 капли красителя на 1 мл дистиллированной воды. Мазки окрашивают 20 - 25 минут при 37 °C во влажной камере (закрытая чашка Петри с увлажнённым фильтром на дне). После окрашивания мазки промывают в проточной воде, сушат на воздухе и исследуют при масляной иммерсии.
Красящую смесь Романовского-Гимзы, которая имеет в основе краску Романовского Райта, в виде порошка (коммерческий краситель) растворяют в смеси равных объемов метилового спирта и глицерина (800 мг красителя на 100 мл растворителя). Краситель растворяется плохо, поэтому лучше его растереть с растворителем в количестве 300 мг на 100 мл, а затем, помешивая, добавлять краситель до получения нужной концентрации. Приготовление красителя часто занимает несколько дней. Важно в качестве растворителей использовать химически чистый метиловый спирт и глицерин, так как примеси ухудшают свойства красителя. Вместо метилового спирта можно применять 100 % этиловый спирт. Приготовленную красящую смесь хранят в сухом прохладном месте в плотно закрытом сосуде.
Методика окраски
Мазки, фиксированные в метиловом спирте, окрашивают раствором (1 мл готовой жидкой краски + 2 мл основного буферного раствора + 47 мл дистиллированной воды) в течение 40-120 мин (продолжительность окрашивания подбирают эмпирически). Пользуются фосфатным буфером, но рН буфера зависит от вида мазка: для мазка костного мозга - 5,8 - 6,0, для мазка крови - 6,4 - 6,5, для выявления простейших - 6,8, малярийного плазмодия - 7,0 - 7,2.
Ополаскивают в дистиллированной воде, высушивают и исследуют при иммерсии.
Результат окраски
Бактерии окрашиваются в фиолетово-красный цвет, цитоплазма клеток - в голубой, ядра - в красный. При окрашивании простейших их цитоплазма приобретает голубой цвет, а ядра - красно-фиолетовый.
Выделяют простые и сложные методы окраски.
Простыми методами окрашивания называют окрашивание пре-
паратов каким-либо одним красителем. Некоторые микроорганизмы (спирохеты) плохо выявляемые с помощью позитивных красителей, легко выявляются при окрашивании негативными красителями.
Техника приготовления препарата состоит в следующем. Фиксированный препарат помещают на параллельные стеклянные рейки (мостик), которые лежат над кюветой. На мазок наносят с помощью капельницы 1 % водный раствор фуксина или метиленового синего на 1–2 мин. Следят за тем, чтобы во время окрашивания раствор красителя не подсыхал. После завершения окрашивания, краситель сливают. Препарат промывают водой до тех пор, пока стекающая воде не станет бесцветной. Далее препарат высушивают. Для этого нижнюю сторону препарата промокают фильтровальной бумагой, а верхнюю сторону осторожно обсушивают с боков, не дотрагиваясь до мазка. Препарат окончательно досушивают на воздухе или высоко над пламенем спиртовки. Для получения более чистых препаратов краситель наносят на мазок, покрытый фильтровальной бумагой. Метод окрашивания в модификации Синева позволяет использовать вместо раствора красителя заранее пропитанную им фильтровальную бумагу. В правильно окрашенном и хорошо промытом препарате поле зрения светлое и чистое, окрашены только клетки. Микроскопируют препараты с иммерсионной системой.
При
сложных (дифференцирующих) методах
окрашивания на один и тот же препарат воздействуют несколькими красящими веществами, одно из которых называется основным, другие – дополнительными. Кроме красителей используются различные обесцвечивающие вещества˸ спирты, кислоты, ацетон и др.
Размещено на реф.рф
С помощью сложных методов окрашивания выявляют цитологические особенности клеток микроорганизмов (клеточные структуры, включения и т. д.).
Окраска по методу Грама является самым универсальным из сложных методов окраски. Окраска положена в основу дифференциации бактерий и отражает способность клеток воспринимать и удерживать внутри клетки красящий комплекс генцианового фиолетового и йода либо терять ᴇᴦο после обработки спиртом. Соответственно выделяют грамположительные (Bacillus, Clostridium, Staphylococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Sarcina, etc.) и грамотрицательные (Escherichia, Pseudomonas, Erwinia, Neisseria, Rickettsia, etc.) формы.
Для получения достоверных результатов необходимо готовить мазки для окраски по Граму из молодых, активно растущих (обычно односуточных) культур, так как клетки из старых культур иногда дают неустойчивую реакцию по Граму. Грамотрицательные бактерии могут выглядеть как грамположительные, в случае если бактериальная пленка (мазок) чересчур толста и обесцвечивание спиртом не проведено до конца. Грамположительные бактерии могут выглядеть как грамотрицательные, в случае если мазок переобесцвечен спиртом.
Сущность метода . На поверхности цитоплазмы клетки у грамположительных микроорганизмов располагается комплекс из белка и рибонуклеата магния, отсутствующий у грамотрицательных бактерий. При окрашивании по Граму на поверхности грамположительных клеток образуется прочный комплекс из белка, рибонуклеата магния, генцианвиолета и йода, не разрушающийся при обработке спиртом. Такие бактерии остаются окрашенными в сине-фиолетовый цвет. Грамотрицательные бактерии не обладают свойством удерживать краску и при обработке спиртом обесцвечиваются. Для выявления их препарат докрашивают фуксином. При этом грамотрицательные бактерии окрашиваются в красный цвет.
Окраску мазка производят простыми или сложными методами. Простые заключаются в окраске препарата одним красителем; сложные методы (по Граму, Цилю-Нильсену и др.) включают последовательное использование нескольких красителей и имеют дифференциально-диагностическое значение. Отношение микроорганизмов к красителям расценивают как тинкториальные свойства. Существуют специальные методы окраски, которые используют для выявления жгутиков, клеточной стенки, нуклеоида и разных цитоплазматических включений.
При простых методах мазок окрашивают каким-либо одним красителем, используя красители анилинового ряда (основные или кислые). Если красящий ион (хромофор) - катион, то краситель обладает основными свойствами, если хромофор - анион, то краситель имеет кислые свойства. Кислые красители - эритрозин, кислый фуксин, эозин. Основные красители - генциановый фиолетовый, кристаллический фиолетовый, метиленовый синий, основной фуксин. Преимущественно для окраски микроорганизмов используют основные красители, которые более интенсивно связываются кислыми компонентами клетки. Из сухих красителей, продающихся в виде порошков, готовят насыщенные спиртовые растворы, а из них - водно-спиртовые, которые и служат для окрашивания микробных клеток. Микроорганизмы окрашивают, наливая краситель на поверхность мазка на определенное время. Окраску основным фуксином ведут в течение 2 мин, метиленовым синим - 5-7 мин. Затем мазок промывают водой до тех пор, пока стекающие струи воды не станут бесцветными, высушивают осторожным промоканием фильтровальной бумагой и микроскопируют в иммерсионной системе. Если мазок правильно окрашен и промыт, то поле зрения совершенно прозрачно, а клетки интенсивно окрашены.
Сложные методы окраски применяют для изучения структуры клетки и дифференциации микроорганизмов. Окрашенные мазки микроскопируют в иммерсионной системе. Последовательно нанести на препарат определенные красители, различающиеся по химическому составу и цвету, протравы, спирты, кислоту и др.
При простых методах окраски используется лишь одна краска.
С этой целью в бактериологии используются, как правило, или водный фуксин или метиленовая синька. Простые методы окраски используются для ориентировочной, предварительной, микроскопии – определения наличия в патологическом материале бактерий, определение их формы и расположения в мазке.
При сложных методах окраски используются ряд красок в определенной последовательности. Такие методы используются для выявления в патологическом материале конкретных микроорганизмов, а также определения особенностей их ультраструктуры.
1. Окраска по Граму используется для определения типа строения клеточной
стенки. Это основной метод в бактериологии. В зависимости от окраски по
Грамму все бактерии подразделяются на грампо-ложительные и
грамотрицательные.
2. Окраска по Цилю-Нильсену используется для выявления кислотоустойчивых
бактерий (а именно – микобактерий), а также для обнаружения спор.
3. Окраска по Нейссеру используется для выявления цитоплазматических
включений волютина и идентификации по их наличию коринебактерий (в частности
– возбудителей дифтерии).
4. Окраска по Бури-Гинсу используется для выявления макрокапсул.
5. Окраска по Морозову используется для выявления жгутиков. Этот метод
окраски используется также для выявления трепонем. Кроме того, окраску по
Морозову используют в вирусологии – для выявления в оспенных пузырьках
вирусов натуральной и ветряной оспы.
6. Окраска по Здрадовскому используется для выявления риккетсий и хламидий.
7. Окраска по Романовскому-Гимзе также, наряду с окраской по Здрадовскому,
используется для вы-явления риккетсий и хламидий; кроме того, этот метод
окраски используется для выявления спирохет (с их идентификацией до рода в
зависимости от цвета окрашивания), а также для выявления простейших.
- Депарафинированные срезы доводят до воды.
- Окрашивают 20 мин в 1 % растворе парарозанилина или основного фуксина в 1 % уксусной кислоте (раствор красителя нагревают до кипения, охлаждают и фильтруют).
- Промывают в 3 сменах дистиллированной воды.
- Окрашивают 5 мин в 1 % кристаллического фиолетового в дистиллированной воде.
- Быстро ополаскивают в 1 % растворе хлорида натрия.
- Обрабатывают 30 с в смеси: 1 часть йода + 2 части йодида калия + 100 частей дистиллированной воды.
- Промокают фильтровальной бумагой.
- Дифференцируют, нанося на срез смесь равных объемов анилина и ксилола (1 - 2 мл); растворы сливают до тех пор, пока облачка красителя не перестанут отходить от среза.
- Проводят через 3 смены ксилола.
- Заключают в бальзам или любую смолу, растворенную в ксилоле.
Результат: грамположительные бактерии сине-черные, фибрин фиолетовый, ядра красные.
Окраска бактерий по по Цилю-Нильсену
Метод используется для окраски спор и кислотоустойчивых бактерий (микобактерии туберкулеза). Кислотоустойчивость связана с наличием в клеточной стенке мяколовых кислот. Метод Циль-Нильсена основан на использовании концентрированных красителей прогревания.
Методика окраски:
| 1. На фиксированный мазок накладывают белую фильтровальную бумагу и наливают карболовый фуксин Циля. Препарат 2-3 раза подогревают в в пламени до появления паров. | Карболовый фуксин-основная краска; прогревание-протрава. |
| 2. Препарат промывают водой, бумагу сбрасывают. | |
| 3. Препарат обесцвечивают в 5% растворе серной кислоты. | Серная кислота-обесцвечивающий фактор. |
| 4. Промывают водой | |
| 5. Докрашивают синькой Леффлера 3-5 минут | Синька Леффлера - дополнительная краска |
| 6. Промывают водой, высушивают, смотрят под иммерсией | Кислотоустойчивые бактерии и споры рубиново- красного цвета, а остальная микрофлора - синего цвета |
Окраска по по Ауески
Метод окраски спор бактерий, заключающийся в обработке препарата горячим 0,5% раствором соляной кислоты с последующей фиксацией и окраской по способу Циля - Нельсена; споры окрашиваются в рубиново-красный цвет, вегетативные формы - в синий.
Препарат помещают на подставку для окраски, исследуемым материалом вверх. Пипеткой наносят на него раствор красителя. По истечении указанного времени краситель осторожно сливают, препарат промывают водой и высушивают фильтровальной бумагой. При простом методе используют один краситель. Метиленовым синим и щелочным синим Леффлера окрашивают препарат в течение 3-5 мин, фуксином Пфейффера - 1-2 мин (см. рис. 4).
На окрашенный и высушенный препарат наносят каплю иммерсионного масла и
Сложные методы окраски
Окраска по Граму (универсальный метод) . Наиболее распространенным методом дифференциальной окраски является окраска по Граму.
В зависимости от результатов окраски все микроорганизмы делят на две группы - грамположительные и грамотрицательные.
Грамположительные бактерии содержат в клеточной стенке магниевую соль РНК, которая образует комплексное соединение с йодом и основным красителем (генциановым, метиловым или кристаллическим фиолетовым). Этот комплекс не разрушается при действии спирта, и бактерии сохраняют фиолетовый цвет.
Грамотрицательные бактерии не способны удержать основной краситель, так как не содержат магниевой соли РНК. Под действием спирта краситель вымывается, клетки обесцвечиваются и окрашиваются дополнительным красителем (фуксином) в красный цвет.
- 1. На препарат накладывают бумажку по Синеву и наносят несколько капель воды или раствор генцианового фиолетового. Окрашивают 1-2 мин. Снимают бумагу или сливают краситель.
- 2. Не промывая водой, наносят раствор Люголя до почернения (1 мин), затем краситель сливают.
- 3. Не промывая водой, наносят 96% спирт до отхождения красителя (30-60 с). Можно опустить препарат в стаканчик со спиртом на 1-2 с.
- 4. Промывают препарат водой.
- 5. Докрашивают фуксином Пфейффера 3 мин, промывают водой и высушивают.
Микроскопируют с помощью иммерсионной системы.
Окраска по Цилю - Нильсену (для кислотоустойчивых бактерий) . Этот метод применяют для выявления бактерий туберкулеза и проказы, имеющих в оболочке клеток большое количество липидов, воска и оксикислот. Бактерии кислото-, щелоче- и спиртоустойчивы. Для увеличения проницаемости клеточной стенки первый этап окрашивания проводят при подогревании.
- 1. Фиксированный препарат покрывают фильтровальной бумагой и наносят фуксин Циля. Удерживая стекло пинцетом, препарат подогревают над пламенем горелки до отхождения паров. Добавляют новую порцию красителя и подогревают еще 2 раза. После охлаждения снимают бумагу и промывают препарат водой.
- 2. Препарат обесцвечивают 5% раствором серной кислоты, погружая 2-3 раза в раствор или наливая кислоту на стекло, затем несколько раз промывают водой.
- 3. Окрашивают водно-спиртовым раствором метиленового синего в течение 3-5 мин, промывают водой и высушивают.
Микроскопируют с помощью иммерсионной системы.
Кислотоустойчивые бактерии окрашиваются в красный цвет, остальные - в синий (см. рис. 4).
Окраска по Ожешко (выявление спор) . 1. На высушенный на воздухе мазок наливают несколько капель 0,5% раствора хлороводородной кислоты и подогревают до образования паров. Препарат высушивают и фиксируют над пламенем.
2. Окрашивают по способу Циля - Нильсена. Кислотоустойчивые споры окрашиваются в розово-красный, а бактериальная клетка - в голубой цвет (см. рис. 4).
Окраска по Бурри - Гинсу (выявление капсулы) . Этот метод назван негативным, так как окрашивается фон препарата и бактериальная клетка, а капсула остается неокрашенной.
- 1. На предметное стекло наносят каплю черной туши, разведенной в 10 раз. В нее вносят каплю культуры. Ребром шлифовального стекла делают мазок, так же как мазок крови, и высушивают.
- 2. Фиксируют химическим способом спиртом или сулемой. Осторожно промывают водой.
- 3. Окрашивают фуксином Пфейффера 3-5 мин. Осторожно промывают и высушивают на воздухе.
Внимание! Фильтровальной бумагой не пользоваться, чтобы не повредить препарат.
Микроскопируют с помощью иммерсионной системы. Фон препарата черный, клетки - красные, капсулы - неокрашенные (см. рис. 4).
Вопрос 5. Простые и сложные методы окраски. Подразделение сложных методов окраски по назначению. Протравы и дифференцирующие вещества. Метод Грама: сущность, этапы окраски, практическое применение.
Ответ: Простой метод окраски является одноэтапным (1 краситель –анилиновые, фуксин, генцианвиолет, метиленовый синий в виде растворов или пропитанных бумажек). Окраска 3-5 минут, промывание, высушивание, микроскопия. Можно получить представление о форме, размерах, расположении (но не о деталях строения).
Сложные
Дифференциальные - позволяющие отличить один вид или группу бактерий от других (по Грамму – характер клеточной стенки, метод Циля-Нильсена - кислотоустойчивые).
Протравы - химические и физические вещества, повышающие окрашиваемость микроорганизмов. Уплотняют цитоплазму и делают окраску более прочной, либо разрыхляют клеточную стенку и способствуют проникновению краски в клетку (раствор Люголя в методе Грама, карболовая кислота в методе Циля-Нильсена)
Дифференцирующие вещества избирательно обесцвечивают одни виды или структуры бактериальных клеток и не обесцвечивают другие
(спирт в методе Грама, серная кислота в методе Циля-Нильсена и Ожешко).
Окраска по Грамму.
|
цель метода |
Выявление грамположительных и грамотрицательных бактерий |
|
основной краситель |
карболовый раствор генцианвиолета |
|
протрава |
раствор Люголя (после окрашивания) |
|
дифференцирующее вещество | |
|
дополнительный краситель |
разбавленный карболовый раствор фуксина |
|
в пламени спиртовки до окрашивания |
|
|
этапы окраски |
Окрасить раствором генцианвиолета 1 мин. (или с бумажкой – 3 мин.); Нанести на мазок раствор Люголя – 1 мин.; Промыть в этаноле 30 сек.; Промыть водой; Окрасить раствором фуксина 1 мин. (или с бумажкой – 5 мин.); Промыть водой; Высушить |
|
сущность метода |
Генцианвиолет образует комплекс с тейхоевыми кислотами в присутствии Люголя, который задерживается многослойным пептидогликаном у грамположительных бактерий. При дополнительной окраске фуксином грамотрицательные бактерии приобретают красный цвет. |
Вопрос 6. Сложные методы окраски, протравы и дифференцирующие вещества. Метод Циля-Нильсена: сущность, этапы окраски, практическое применение.
Ответ: Сложные методы многоэтапные, различные красители, протравы, дифференцирующие вещества. Сложные методы бывают:
Дифференциальные (отличить группы (по Грамму - характер клеточной стенки, метод Циля-Нильсена -кислотоустойчивые).
Предназначенные для выявления различных структур (споры- Ожешки, включения волютина-Нейссера, капсула- Бурри-Гинса).
Протравы - химические и физические вещества, повышающие окрашиваемость микроорганизмов. Уплотняют цитоплазму и делают
окраску более прочной, либо разрыхляют клеточную стенку и способствуют проникновению краски в клетку (раствор Люголя в методе Грама, карболовая кислота в методе Циля-Нильсена)
Дифференцирующие вещества - вещества избирательно обесцвечивают одни виды или структуры бактериальных клеток и не обесцвечивают другие (спирт в методе Грама, серная кислота в методе Циля-Нильсена и Ожешко).
Метод Циля-Нильсона:
|
цель метода |
Выявление кислотоустойчивых и некислотоустойчивых бактерий |
|
основной краситель |
карболовый раствор фуксина |
|
протрава |
карболовая кислота (в момент окрашивания) |
|
дифференцирующее вещество |
серная кислота |
|
дополнительный краситель |
водный раствор метиленового синего |
|
способ фиксации препарата-мазка |
в пламени спиртовки в процессе окраски |
|
этапы окраски |
Окрашивать карболовым раствором фуксина (фуксин Циля) через фильтровальную бумажку при осторожном нагревании над пламенем спиртовки 3 раза до появления паров белого цвета (1); Промыть в 5% серной кислоте; Промыть водой; Окрасить раствором метиленового синего 1 мин.; Промыть водой; Высушить |
|
сущность метода |
При частичном гидролизе клеточной стенки фуксин взаимодействует с миколовыми кислотами и образует комплекс в присутствии фенола. Фенол разрыхляет бактериальную оболочку и краска проникает внутрь клетки. Кислотоустойчивые -красные, некислотоустойчивые - синие |
Практическое применение : для диагностики заболеваний (туберкулез)
Вопрос 7. Клеточная стенка бактерий: особенности строения у грамположительных и грамотрицательных бактерий, функции, методы выявления. Особенности строения клеточной стенки кислотоустойчивых бактерий. L -формы бактерий.
Ответ:
Клеточная стенка. Располагается над ЦПМ.
КС обеспечивает постоянную форму клетки, механическую и осмотическую защиту, взаимосвязь с окружающей средой, несет рецепторы для бактериофагов.
Отдельные соединения в составе КС обладают целым спектром иммунобиологических свойств : участвуют в адгезии, угнетении фагоцитоза, обладают иммуномодулирующей активностью и т.д.
Химический состав и строение клеточной стенки постоянны и являются важным таксономическим признаком.
В зависимости от строения клеточной стенки прокариоты, относящиеся к эубактериям, делятся на две большие группы: грамположительные и грамотрицательные бактерии.
Основа -пептидогликан , обеспечивающий ригидность и эластичность КС.
Структура: N-ацетилглюкозамина и N-ацетилмурамовой кислоты, соединенных между собой посредством гликозидных связей.
К каждому остатку N-ацетилмурамовой кислоты присоединен короткий пептид из 4-5 аминокислот.
Две особенности пептидного хвоста заслуживают внимания: наличие аминокислот в D-форме (неприродная конфигурация) и высокое содержание аминокислот с двумя аминогруппами. Это имеет принципиальное значение для пространственной организации пептидогликана. Обе аминогруппы этих аминокислот могут участвовать в образовании пептидных связей.
У грамположительных эубактерий он составляет основную массу вещества клеточной стенки (от 40 до 90%), у грамотрицательных - содержание пептидогликана значительно меньше (1-10%).
Функции клеточной стенки:
Обусловливает форму клетки.
Защищает клетку от механических повреждений извне и выдерживает значительное внутреннее давление.
Обладает свойством полупроницаемости, поэтому через нее избирательно проникают из среды питательные вещества.
Несет на своей поверхности рецепторы для бактериофагов и различных химических веществ.
Особенности строения КС Гр+
Клеточная стенка грамположительных бактерий достаточно плотно прилегает к ЦПМ.
Пептидные сшивки в пептидогликане обеспечивают его трехмерную пространственную организацию.
Многослойный пептидогликан пронизывают тейхоевые кислоты – полифосфатные соединения на основе рибитола или глицерина.
Тейхоевые кислоты ковалентно могут соединяться с N-ацетилмурамовой кислотой (собственно тейхоевые или стеночные) или с гликолипидом ЦПМ (липотейхоевые).
Свободные гидроксилы фосфорной кислоты придают тейхоевой кислоте свойства полианиона, определяющего поверхностный заряд клетки.
Особенности строения КС Гр-
Пептидогликан образует только тонкий внутренний слой клеточной стенки, неплотно прилегающий к ЦПМ.
У большинства видов пептидогликан образует одно- или двухслойную структуру, характеризующуюся весьма редкими поперечными связями между гетерополимерными цепями.
Снаружи от пептидогликана располагается дополнительный слой клеточной стенки - наружная мембрана. Она состоит из фосфолипидов, типичных для элементарных мембран, белков, липопротеина и липополисахарида (ЛПС).
ЛПС сложного молекулярного строения, занимает около 30-40% поверхности наружной мембраны и является ее важнейшим компонентом.
Методом выявления клеточной стенки является метод Пешкова (КС –красная; цитоплазма –розовая), по Грамму-тип стоения клеточной стенки.
Метод выявления клеточной стенки: Метод Пешкова
Этапы окраски :
1.мазок протравливать в 10% растворе танина 6-8 мин
2.промыть водой
3.окрашивать водным раствором фуксина 30-60 сек
4.высушить
Сущность метода : танин уплотняет клеточную стенку бактерий, и большая часть фуксина задерживается в ней
Цель : выявление клеточной стенки. КС - красная, цитоплазма -розовая
Особенности клеточной стенки кислотоустойчивых бактерий
Клеточная стенка кислотоустойчивых бактерий содержит большое количество липидов и восков, делающих их устойчивыми к последующему после окрашивания обесцвечиванию кислотами, щелочами или этанолом (например, виды Mycobacterium или Nocardia). Для их окраски применяют метод Циля-Нильсена .
L-формы
Если бактерии частично или полностью утратили клеточную стенку, но сохранили способность к размножению, они называются L-формами.
L-формы бактерий образуются под воздействием препаратов, ингибирующих синтез пептидогликана (антибиотик пенициллин) или разрушающих пептидогликан (лизоцим).
Изучают L-формы в фазово-контрастном микроскопе
Воспрос 8. Капсула бактерий: химическая природа, строение, функции, значение. Методы выявления капсул. Примеры инкапсулированных бактерий.
Капсула бактерий располагается поверх клеточной стенки. Она защищает бактериальную клетку во внешней среде от механического повреждения, высыхания, ядовитых веществ, бактериофагов, фагоцитов(в инфицированном организме). Выявление: в мазках-отпечатках из органов зараженных животных(простой метод, метод Грама). Тела бактерий окрашены на фоне окрасившейся ткани органа,окружены белым ореолом капсулы(капсула не окрашивается). Метод Бурри-Гинса (для окраски чистой культуры капсульных бактерий).
Метод выявления капсул: метод Бурри-Гинса
Цель метода : выявление капсулы у бактерий
Этапы окраски :
1.в каплю туши добавить каплю жидкости с микроорганизмами и растереть тонким слоем как мазок крови
2.высушить и зафиксировать в пламени горелки
3.окрасить карболовым фуксином 1мин
4.высушить
Сущность метода : капсула не окрашивается, задерживает тушь на поверхности, а фуксин окрашивает бактериальную клетку
Пример инкапсулированных бактерий : Klebsiella pneumoniae , Bacillus cereus
Воспрос 9. Жгутики у бактерий: строение, типы расположения, функции, способы выявления. Ворсинки: фимбрии, пили, подразделение, строение, функции. Примеры бактерий.
Жгутики являются органами движениями, представляют собой нитевидные придатки,состоят из белка флагеллина; прикрепляется к бакт.клетке с помощью базального тельца(система дисков и крючка, к которому прикреплена жгутиковая нить). Монотрихи (один жгутик),перитрихи (жгутики по всей поверхности бакт клетки), лофотрихи (пучок жгутиков на одном конце клетки), амфитрихи (единичные жгутики или пучки на разных полюсах клетки). Способы выявления: метод серебрения(жгутики искусственно утолщаются и становятся видимыми в иммерсионном микроскопе); наличие жгутиков определяется по активной подвижности микробных клеток.
Ворсинки(фимбрии и пили) состоят из белка пилина, видны только в электронном микросопе(тонкие и короткие). F -пили (половые, обеспечивают конъюгацию междубактериями);фимбрии общего порядка (адгезия).
Примеры бактерий: Половые пили Е. соli
Salmonella Typhi - перитрихи
Vibrio cholerae - монотрихи
Campylobacter jejuni - лофотрихи или амфитрихи
Воспрос 10. Споры бактерий: типы расположения спор в клетке, строение споры. Причины устойчивости спор к воздействию факторов внешней среды. Методы выявления спор. Примеры спорообразующих бактерий.
Эндоспора- являются приспособлением бактерий для сохранения вида в неблагоприятных условиях внешней среды. В одной бактериальной клетке образуется только одна спора! Такой способностью обладают бактерии рода Bacillus и Clostridium . (Bacillus – центральное расположение спор, не превышают поперечник клетки; Clostridium-крупные споры, субтерминально/терминально,в месте нахождения споры клетка раздувается, приобретая веретенообразную форму).Высокая резистентность ,причины: низкое содержание свободной воды, высокое содержание кальция,наличие дипиколиновой кислоты и белка, богатого цистеином,наличие нескольких оболочек). Окрашивание спор-метод Ожешки.(на высушенный мазок наложить фильтовальную бумажку, налить 0,5% раствор соляной кислоты и нагревать над пламенем спиртовки до появления пара 3 раза;далее окрашивать по Цилю- Нильсену.(Вегетативные клетки в готовом мазке-голубого цвета,споры-рубиново-красные).
Воспрос 11. Ультраструктура бактериальной клетки. Строение цитоплазматической мембраны, функции, методы выявления. Особенности строения наружной мембраны грамотрицательных бактерий.
ЦМП-основной барьер,который ограничивает протопласт бактерий,выявляется только в электронном микроскопе;состоит из двойного слоя фосфолипидов,куда включены интегральные и неинтегральные белки;от мембраны эукариот отличается отсутствием стеролов.
Функции : участвует в процессах избирательного активного транспорта молекул из внешней среды, является осмотическим барьером и осмотическим мостиком, выделяет гидролитические ферменты, в ее состав входят ферменты электрнонно-транспортной цепи,с ней связана АТФ-аза, содержит ферменты комплекса репликации ДНК нуклеоида,в ней фиксируются жгутики и ворсинки,имеет ферментный аппарат,участвующий в синтезе своих собственных структур, клеточной стенки.
Мезосомы - инвагинации ЦПМ внутрь клетки. Играют роль в репликации хромосомы и ее последующем расхождении по дочерним клеткам, разграничивает внутреннее содержимое на отсеки. Мезосомы грамотрицательных бактерий-простые инвагинации, грамположительных имеют сложную морфологию (везикулярные,трубчатые,пластинчатые).
Наружная мембрана грамотрицательных бактерий связана посредством липопротеина с подлежащим тонким слоем пептидогликана; внутренний компонент-фосфолипидный бислой, в наружном расположен липополисахарид (является О-антигеном, состоит из: липида А-консервативная структура; ядра, или стержневой, коровой части-олигосахаридная структура; высоковариабельного О-специфического олигосахарида). Белки- порины пронизывают мембрану, образуя гидрофильные поры, также являются рецепторами для бактериофагов.(из учебника)
Воспрос 12. Ультраструктура бактериальной клетки. Рибосомы: строение рибосом у прокариот, функции. Отличия в строении рибосом эукариотических клеток. Цитоплазматические включения у бактерий: химическая природа, функции, способы выявления, значение.
Рибосомы прокариот имеют константу седиментации 70 S. Они построены из двух частиц: 30 S (малая субъединица) и 50 S (большая субъединица). S - это коэффициент седиментации, который характеризует скорость перемещения молекул или частиц в центробежном поле при центрифугировании. Рибосомы рассеяны по всей цитоплазме
В клетке эукариот имеют 80S рибосомы прикреплены к эндоплазматическому ретикулуму. Функция: синтез белков
Включения- зерна волютина,содержащие поли- и мета-фосфаты. (Corynebacterium diphtheria). Окрашиваются простым методом Леффлера(окраска фиксированного в пламени горелки мазка щелочным мителеновым синим 5 мин. Тела бактерий-голубые,зерна волютина- темно-синие ) и сложным методом Нейссера (фиксированный в пламени горелки мазок окрашивают уксусно-кислой синькой в течении 1 минуты,промывают водой,протравливают раствором Люголя 30 скекунд и докрашивают везувином. Препарат промывают водой, высушивают, микроскопируют. Тела бактерий-желтые , зерна волютина- темно-синий цвет , расположены на обоих концах клетки) .
Воспрос 13. Ультраструктура бактериальной клетки. Нуклеоид бактерий: строение, функции и методы выявления. Особенности организации генетического аппарата прокариот и эукариот.
Нуклеоид у прокариот - генетический аппарат бактерий не имеет ядерной оболочки и представлен одной кольцевой двунитевой суперспирализованной молекулой ДНК,которая является хромосомой; располагается в цитоплазме,не содержит белков гистонов. Не способен к митозу
Генетический аппарат всех эукариот находится в ядре и защищён ядерной оболочкой.ДНК эукариот линейная. Хромосомы как структуры. Содержит белки-гистоны. Способен к митозу
Выявляют при электронной микроскопии, Романовского- Гимзы.
метод Романовского-Гимзы
Цель метода : выявление нуклеоида; нуклеоид - сине-фиолетовый; цитоплазма - розовая
Сущность метода : Амур и метиленовый синий окрашивает участки клетки со слабощелочным pH , эозин с кислым
Этапы окраски :
1.провести кислотный гидролиз в растворе соляной кислоты при нагревании
2.промыть водой
3.окрашивать краской Романовского-Гимзы 40-60 мин
4.высушить
14. Актиномицеты : морфология чистой культуры и структура друзы актиномицетов. Методы изучения. Роль в инфекционной патологии человека.
Актиномицеты - группа нитчатых грамположительных прокариот. Виды актиномицет представляют собой тонкие неспорообразующие полиморфные палочки и нити(гифы) с ветвлением; гифы переплетаясь, образуют мицелий.
Актиномицет у здорового человека обитают в полости рта и кишечном тракте, не причиняя ему вреда, но снижение иммунитета организма может вызвать заболевание - актиномикоз (развиваются гнойные хронические процессы с поражением любых органов и тканей).
В пораженном организме актиномицеты образуют друзы , имеющие звездчатую, лучистую форму. Центр друзы состоит из компактного кальцинированного плотного мицелия, а периферийные гифы покрыты капсулоподобными эозинофильными чехлами, выполняющими защитную функцию.
Для изучения актиномицет применяют методы Грама и Циля-Нильсена
15. Микоплазмы : таксономия, строение клетки, особенности морфологии, биологические свойства, методы культивирования и выявления. Роль в инфекционной патологии человека.
Ответ : Класс - Mollicutes
Порядок - Mycoplasmatales
Семейство - Mycoplasmataceae
Род - Mycoplasma
Микоплазмы - полиморфные микроорганизмы, отличающиеся от других прокариотов отсутствием клеточной стенки
Поверхностной оболочкой микоплазм является цитоплазматическая мембрана, более прочная и эластичная (т.к. в ней присутствует холестерин). Клетки микоплазм содержат нуклеоид(самый маленький), рибосомы, цитоплазму и цпм (без мезосом). У некоторых микоплазм обнаружены микроворсинки (Mycoplasma pneumoniae) и нитчатые выросты различной длины, которые принимают участие в скользящем движении клеток и адгезии.
Для культивирования микоплазм используют специальные полужидкие среды , на которых через 2-4 недели получают видимый рост в виде колоний, напоминающий "яичницу- глазунью"(из-за хрупкости микоплазм - т.к. Отсутствует клеточная стенка).Их изучают в нативных препаратах в фазово-контрастном микроскопе (не удается окрасить из-за хрупкости)
16. Риккетсии : таксономия, биологические свойства, морфологические формы, методы окраски, методы культивирования. Жизненный цикл риккетсий. Роль риккетсий в патологии человека (назовите заболевания и соответствующих им возбудителей).
Ответ : Царство - Bacteria
Порядок - Rickettsiales
Семейство - Rickettsiaceae
Род - Rickettsia
Риккетсии - грамотрицательные полиморфные бактериоподобные прокариоты,капсул,спор не образуют. Облигатные внутриклеточные бактерии, которые не растут на простых питательных средах. Жизненный цикл риккетсий включет 2 стадии - вегетативную и покоящуюся . В вегетативной стадии риккетсии активно размножаются путем бинарного деления; покоящаяся форма обладает повышенной резистентностью(меньших размеров, с утолщенной клеточной стенкой).
Различают 4 морфологические формы риккетсий (по Здродовскому ) :
Кокковидную (d= 0,3-0,4мкм)
Палочкивидную (1-2 мкм)
Бациллярную(3-5 мкм)
Нитевидную(до 40 мкм)
Риккетсии культивируются в желточных мешках куриных эмбрионов, перевиваемых культурах клеток, легких белых мышей. Риккетсии можно культивировать путем инфицирования ими переносчиков возбудителей инфекций - вшей, блох, клещей. Для окраски риккетсий применяют сложные методы - Романовского-Гимзы и Здродовкого
Методика окраски :
1.фиксированный в пламени горелки мазок окрашивают разведенным карболовым фуксином Циля(без нагревания)
2.промывают водой
3.обесцвечивают слабым раствором органической 0,5% лимонной к-ты, 0,15% уксусной к-ты или минеральной кислоты (0,01% HCL)
4.промывают водой и докрашивают водным раствором метиленового синего
Результат окраски : риккетсии - в рубиново-красный; цитоплазма - голубая; ядро - синее
Патогенные для человека риккетсии являются возбудители риккетсиозов, для которых характерны сыпнотифозные или пятнистые лихорадки. Например, Rickettsia prowazekii вызывает эпидемический вшивый сыпной тиф.
17. Хламидии : таксономия, морфология и ультраструктура, жизненный цикл. Методы выявления и культивирования. Роль в инфекционной патологии человека.
Ответ : Семейство - Chlamydiaceae
Род - Chlamydia
ЭТ - внеклеточная инфекционная частица (0,2-0,4 мкм), содержит компактный нуклеоид, рибосомы, жесткую клеточную стенку. ЭТ проникает в чувствительную клетку путем эндоцитоза, вокруг него образуется вакуоль. Внутри вакуоли ЭТ разбухает, приобретает сетчатую структуру, увеличивается до 0,5-1,5 мкм и превращается в РТ.
РТ внутри вакуоли многократно делится путем образование поперечных перегородок. Вакуоль заполняется микро-колониями хламидий, содержащих большое количество РТ в процессе деления, промежуточные тельца и ЭТ. Вакуоль превращается во внутриклеточное включение, покрытое оболочкой - хламидой, расположенное в цитоплазме клетки-хозяина. Выход хламидий из клетки - через неповрежденную мембрану или при гибели клетки. Освободившиеся ЭТ внедряются в другие здоровые клетки, где цикл развития повторяется.
Изучают хламидии в живом состоянии, в фазово-контрастном микроскопе и окрашивают методом Романовского-Гимзы (ЭТ - розовые, РТ - сине-голубые).
Патогенны: Chlamydia trachomatis (трахома и урогенитальные инфекции), Chlamydia pneumoniae (респираторные инфекции), Chlamydia psittaci (орнитоз).
18. Спирохеты : таксономия, биологические свойства, ультраструктура клетки, цисты. Методы изучения спирохет нативных и окрашенных препаратов. Роль спирохет в инфекционной патологии человека.
Семейство – Spirochaetaceae
Спирохеты - тонкие нитевидные, спирально извитые микроорганизмы, обладающие активной подвижностью. Относятся к грамотрицательным прокариотам. Клеточная стенка эластичная, что позволяет им совершать колебательные, вращательные и сгибательные движения.
Двигательный аппарат представляет собой фибриллярный тяж, состоящий из 2х пучков фибрилл, расположенных субтерминально на обоих концах клетки. Фибриллы пролегают в клеточной стенке, обвивая цитоплазматический цилиндр (протопласт). В середине клетки фибриллы перекрывают друг друга. Фибриллы состоят из белка флагеллина.
Спирохеты изучают в нативных препаратах, используя темно-польную микроскопию для выявления их форм и подвижности. Их Ультраструктуру изучают с помощью электронной микроскопии. Для изучения спирохет в окрашенном состоянии применяют: метод Романовского-Гимзы (боррелии в сине-фиолетовый, трепонемы в бледно-розовый, лептоспиры в красно-розовый), метод серебрения по Морозову (спирохеты имеют вид тесно-коричневых спиралей на светло-желтом фоне препарате),негативный способ Бурри (тушь не проникает тела микробов,на темном фоне белые контуры спирохет)
существенную роль в инфекционной патологии человека играют роды Treponema, Borrelia и Leptospira. Treponema pallidum - возбудитель сифилиса, Borrelia recurrentis - возбудитель возвратного тифа, Leptospira interrogans является возбудителем лептоспироза
19. Микроскопические грибы : морфология, ультраструктура. Размножение плесневых и дрожжевых грибов. Методы изучения. Роль в инфекционной патологии человека.
Протопласты (содержимое клетки, заключенное в клеточную стенку) клетки грибов содержат ядро с ядрышком, митохондрии, лизосомы, эндоплазматический ретикулум, рибосомы, фагосомы, вакуоли и др. Снаружи протопласты покрыты ЦПМ с высоким содержанием стеролов (главным образом эргостерола) и плотной клеточной стенкой,в состав которой входят хитин, целлюлоза, глюкуроновая кислота, глюканы, различные углеводы, липиды, белки, пигменты.
По морфологическим особенностям грибы подразделяются на группы: плесневые грибы и дрожжеподобные грибы
Плесневые грибы образуют мицелий (тело гриба), который состоит из переплетенных гифов. На питательной среде плесневые грибы образуют субстратный мицелий, который прорастает в нее, извлекая из среды все необходимые для роста и размножения вещества, и воздушный мицелий,на котором созревают неполовые споры,с помощью которых грибы размножаются. Бесполовой путь у плесневых грибов характеризуется образованием большого количества экзоспор или эндоспор. Многие грибы могут размножаться и половыми спорами(половым путем).
Дрожжевые грибы размножаются почкованием.
Морфологию грибов изучают в нативных препаратах "раздавленная капля" в затемненном поле зрения, фазово-контрастном и люминесцентном микроскопе и с помощью окраски простым методом, по Граму, Цилю-Нильсену,Нейссеру
Заболевания вызываемые микроскопическими грибами - микозы.Грибковое заболевание Кандидоз - вызывается Candida albicans
РАЗДЕЛ ФИЗИОЛОГИЯ.
